HRMS란? 쉽게 설명한 High Resolution Mass Spectrometry - 고분해능 질량분석기, MS2, Tandem mass, MS/MS 개념 정리 - 2편

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LC-MS란? 쉽게 설명한 Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 액체크로마토그래피-질량분석기

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질량분석기(MS, Mass Spectrometry)란? 쉽게 설명한 MS1, ESI, Quadrupole, ToF, m/z 개념 정리 - 1편

LC-MS도, MS도 화학물질 동정에 있어 큰 역할을 하지만, 물질의 구조를 규명하거나 각 물질 사이의 상관관계에 대해 알아보기 위해서는 LC-MS로는 약간의 한계가 존재한다. LC-MS로는 UV spectrum과 XXX.X 이런 식의 m/z가 구해지는데, 어떤 실험을 하느냐에 따라 단서가 부족할 수 있다.

 

UV는 물질의 구조적인 특징을 알 수 있게 해주지만, 여러가지 한계점이 존재한다.

- 용매(메탄올이나 ACN 등)또한 UV를 가지기 때문에 용질의 UV 파장대와 용매의 UV 파장대가 겹치는 경우 확인이 어렵다.

- UV가 없는 경우(단일결합으로 이루어져있는 경우나 UV파장대 밖으로 나가는 경우 등등)가 있다.

- cyclopeptide(단백질이 원형으로 이어져있는 경우)나 큰 분자들은 비슷하게 생긴 UV 스펙트럼을 갖는 경우가 있다.

- UV peak이 만들어지기에(UV detector이 감지할 수 있는 감도) 물질의 양이 너무 적은 경우에도 MS는 측정이 되지만(MS감도가 UV보다 높다)UV가 보이지 않는다.

이러한 한계점 없이 화학물질의 분자구조를 알아내려면 NMR 등의 추가적인 정보가 필요하지만 NMR은 값비싼 기기가 필요할 뿐 아니라 기본적인 정제가 필요하고 샘플 전처리도 비교적 까다롭다(측정비도 비싸다). 분자구조까진 아니더라도 샘플에 들어있는 물질이 A라는 물질이 맞다는 확신을 갖기에는 UV와 m/z값으로 알아낸 분자량만 가지고는 신뢰도가 떨어진다.

물론 불순물 제거 / 정량 분석 등 물질 후보가 추려져 있는 상황이거나 타겟하는 물질이 많이 포함되어있을 거라고 기대되는 상황에서는 LC-MS로만 판정이 가능하다.

하지만 미지의 물질을 정성 분석하는 상황에서는 판단을 하기 어렵다.

 

그리고 m/z에도 한계점이 존재한다.

이 사진이 일례가 될 수 있는데, 우리는 이 세 물질을 LC-MS로 찍었을 때 모두 m/z 200.0으로 확인할 수 있다.

분자량은 동위원소비를 적용해 계산하기 때문에 소수점 셋째,넷째,다섯째 자리까지 내려갈 수 있는데, 사소한 동위원소비의 차이로 완전히 동일한 분자량을 갖는 물질은 거의 없지만 기기의 오차범위와 성능때문에 모두 같은 분자량으로 보이게 될 수 있다.

이 성능에 따라 MS의 성능이 달라지는데, 소수점 몇째 자리까지 정확하게 측정할 수 있는지와 픽들 사이의 분해능(픽이 겹치지 않게 분리하는 것. 망원경의 분해능과 유사한 개념)에 따라서 Low resolution MS와 High resolution MS로 분류한다.

이 중 High resolution MS를 HRMS라고 부른다.

 

그런데도 HRMS로도 완벽하게 정확한 분자량을 구하기는 어렵다.

저기 보면 Monoisotopic mass와 Molecular weight이 따로 있는 것을 볼 수 있는데,

Monoisotopic mass는 1H, 2H, 3H같은 동위원소 중 가장 가벼운 동위원소들로만 이루어졌을 때의 질량, Molecular weight은 분자량이므로 위에서 설명했듯 동위원소비를 적용해 계산한다.

그래서 HRMS로 분석을 해도 그 주변의 동위원소들 조성에 따라서 저 값과 완전히 동일한 값이 나오지 않을 수 있다.

그래서 물질을 알아내기 위한 새로운 방법을 고안한 것이 MS/MS(Tandem MS) 이다.

 

Tandem mass는 MS를 여러 대 연결한다는 것인데, 보통은 2개를 연결한다.

MS/MS 는 MS-MS인 것이다! 그래서 LC/MS/MS 나 LC-MS/MS로 표기하곤 하는데, LC와 MS와 MS가 연결된 시스템이라는 뜻이다.

여기서 첫번째 MS를 MS1, 두번째 MS를 MS2라고 부른다.

MS를 연결하면 왜 좋을까?

 

물질에 에너지를 가하면 화학물질의 결합들이 떨어져 분자가 쪼개질 수 있다.

MS/MS는 그걸 이용한다.

 

이 그림에서 두 물질은 모두 분자량이 1000인데, 이걸 MS로 찍으면 1000이 뜰 것이다.

MS2는 이 물질들에 에너지(전압)를 줘서 떨어지기 쉬운 결합들을 떼어낸다.

그러면 MS1에서 1개의 1000짜리 픽으로 뜨던 스펙트럼이 MS2가 20V의 에너지를 줬을 때 왼쪽 물질은 600 하나, 100짜리 픽 4개가 뜨는 것이다. 마찬가지로 오른쪽의 물질은 600 하나, 50짜리 픽 8개가 뜨는 것이다.

더 강한 에너지를 주면 약한 에너지에서는 유지되고 있던 결합마저 떨어져 더 잘게 쪼개질 수 있다.

 

얼마만큼의 에너지를 줬을 때 어떤 조각들이 생기는지가 화학구조에 기반한 물질의 고유한 특성이 된다.

 

이걸 이용해서 MS1에서 측정한 m/z (Precursor mass)에 해당하는 물질이 MS2에서 몇 V에서 어떤 픽들로 쪼개졌는지(Fragmentation pattern) 많은 연구가 이루어졌고, 그걸 모아놓은 데이터베이스들이 있는데, 이 데이터베이스를 이용해 내 샘플에 들어있는 물질이 뭔지 알 수 있다.

가장 흔하게 쓰이는 건 GNPS(Global Natural Products Social Molecular Networking)라고 불리는 시스템이다.

LC-MS/MS가 있다면 화합물의 동정은 큰 무리 없이 진행할 수 있다.

이렇게 LC, LC-MS, LC-MS/MS 등에 대한 개념이 있다면 진학을 위한 배경지식에 큰 도움이 될 것이라 생각한다:)