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LC-MS란? 쉽게 설명한 Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 액체크로마토그래피-질량분석기
다양한 실험적 방법을 찾아보다 보면, LC-MS나 LC, HPLC, HRMS 등의 단어들을 쉽게 볼 수 있다. 하지만 관련된 교육을 듣거나 자세히 찾아보지 않는 한, 이 기기가 무엇을 하는 것인지 알기 어렵다.(내
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지난 글에서 언급했던 것은 LC-MS에 대한 전반적인 설명이었는데, MS를 거친 데이터를 해석하려면 MS의 구조를 이해하는 것이 필요하기 때문에 따로 2편에 나눠서 질량분석기에 대한 글을 작성하고자 한다.
1. m/z란?
질량분석기는 말 그대로 질량을 분석하는 기기로, 우리가 흔히 말하는 물질의 질량은 분자량이다.
분자량은 Molecular weight이므로 MW라고 줄여 표기하기도 한다.
그럼 m/z는 뭘까?
m/z는 m of z 혹은 mass to charge라고 부르는데(mass-to-charge ratio가 표준.), 뒤에서 설명할 이온의 질량과 전하의 비율을 나타낸 것이다.
이온의 질량이 100, 전하가 +1이면 m/z가 100, 전하가 +2면 m/z=50이 되는 것이다.
물질의 질량이 이온의 질량과 무슨 차이일까?
MS의 기본적 원리는 전기적인 방법으로 물질의 분자량을 알아내는 것이므로, 전하를 띠어야 측정이 가능하다.
즉, 물질이 전하를 띠게 되면 이온이 되는 것이니 우리는 이온을 이용하여 분자량을 찾는 것이다.
따라서 이온이 되지 않는 물질은 기본적으로 질량 분석이 불가능하다(하지만 그것을 가능하게 하는 기술도 있다.)
2. MS1(MS)의 작동 원리
MS는 MS1과 MS2로 또 나눌 수 있는데, 1편에서는 LC-MS에 붙어있는 기본적인 MS에 대해서 이야기를 하겠다.
MS1은 2가지 단계로 작동한다.
1) 이온화 2) 질량 측정
말 그대로 물질을 이온화해서, 전기적 방법으로 질량을 측정한다!
이제 이 이온화와 질량 측정의 방법을 간략하게 알아보도록 하겠다.
1) 이온화
a. 전자 분무 이온화(ESI, Electron Spray Ionization): 샘플(질량을 알고싶은 물질)을 용매(ACN이나 메탄올 등등)에 녹인 후 전압이 걸린 얇은 관(주삿바늘보다 훨씬 얇은 바늘. Needle이라고 부른다.)을 통해 엄청 가는 입자로 뿌린다.
이건 그냥 뿌리는 게 아니고, 기기 내부에서 진공이 잡힌 구멍을 앞에 두고 뿌리게 된다.
이때 질소 기체를 고온으로 만들어서 샘플이 녹은 용매와 같이 바늘 끝에서 뿜어져 나오면서 분무가 생긴다.
고전압이 걸린 바늘의 전기장 안에서 용매에 녹은 샘플이 질소와 함께 높은 온도로 뿜어져 나오면, 아주 빠르게 용매방울은 점점 작게 쪼개지다가 나중에는 이온이 된 물질만 남기고 용매는 증발해 사라진다.
이온이 된 물질은 앞에서 말했던 진공이 잡혀있는 질량분석 파트로 빨려들어가게 된다.
b. 기질 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization): 샘플을 결정화하여 강한 레이저를 쏜다.
샘플을 용매에 녹인 후 매트릭스(기질. 작은 유기물질)과 혼합해서 Target plate(말디판)에서 건조시켜 결정화시킨다.
이 말디판을 진공 챔버 안에 놓고 매트릭스에 레이저를 쏘면, 매트릭스와 샘플이 에너지를 받아 승화되고, 매트릭스 분자와 샘플 분자가 충돌하며 샘플 분자를 이온화한다.
이온들은 전기장에 의해 질량 분석 단계로 이동한다.
보통 말디라고 부르며, 고분자 화합물이나 생체분자처럼 이온화되기 어려운 물질에 사용한다.
c. 전자 이온화(EI, Electron Ionization): 샘플을 기화시켜 고에너지 전자를 충돌시켜 이온화를 일으킨다.
고에너지 전자를 충돌시키고, 샘플이 기화되기 때문에 큰 물질은 쪼개질(해리될) 우려가 있다.
그리고 일반 대기압에서는 고에너지 전자를 만들기 위해 사용되는 필라멘트가 빨리 고갈되기 때문에 보통 GC(Gas chromatography. 기체 크로마토그래피)와 같이 사용된다.(GC는 진공에 가깝기 때문에 필라멘트 수명이 조금 더 길어지는 듯)
LC는 액체이니 보통 LC에 MS를 붙여 사용하면 샘플이 LC부터 들어가서 UV를 측정하고 MS로 이동해서 ESI 형태로 분무되고,
GC는 기체이니 GC에 MS를 붙여 사용하면 샘플이 GC부터 들어가서 기체 그대로 EI시켜 MS에 사용된다고 보면 쉽다.
d. 화학 이온화(CI, Chemical Ionization): 샘플이 반응기체 이온과 반응해 이온화된다. EI에 비해 덜 쪼개진다고 한다.
2) 질량 분석
이온의 질량을 알아내는 과정이다.
결과는 똑같이 444.4나 181.2 이런 숫자이지만 측정하는 방법이 다르다.
a. 사중극자(Quadrupole): 진동하는 전기장 아래에서 이온의 궤도에 따라 분리해 질량을 측정한다.
b. 비행 시간(TOF, Time of Flight): 이온을 전기장으로 가속시키면 무거운 건 속도가 느릴거고, 가벼운 건 빠를 거다.
말 그대로 얼마나 오래 날아다녔는지로 질량을 측정한다.
c. 이온 트랩(Ion Trap): 이온을 3차원 전기장에 가두고 m/z에 따라 선택적으로 방출한다.
d. 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR,Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance): 이온을 자기장에 가두고 사이클로트론 주파수를 측정해 m/z로 환산한다.
사이클로트론 주파수는 균일한 자기장 내에서 전하를 띤 입자가 원운동을 할 때의 주파수라고 한다.
e. 오비트랩(Orbitrap): 이온이 중앙 전극 주위를 돌면 m/z와 관련된 주파수에서 진동하는 것을 기준으로 질량을 측정한다.
요즘은 사중극자와 비행시간을 결합한 QToF(Q+ToF)도 있는데, 이건 2편에서 설명하도록 하겠다.
질량분석 과정에서는 저울로 무게를 재는 것처럼 영점을 잡는 과정이 꼭 들어가야 한다.
질량을 확실하게 알 수 있는 물질을 넣어서 '얘가 500이야' 하고 기준을 잡아줘야 그걸 기준으로 질량을 측정한다.
보통은 여러개의 물질을 섞어서 Tune mix 혹은 Tuning mix, Tuning mixture 등등 다양한 이름의 소모품으로 판다.
('얘가 100, 얘가 200, 얘가 400...' 이런 식으로 여러 개의 기준을 잡게 해서 오차 줄이기)
전기영동에서 쓰는 DNA Ladder같은 느낌?
그래서 Tune mix가 오염(Tune mix contamination)되면 기준이 잡히지 않기 때문에 샘플을 찍어도 m/z값이 난리가 난다고 한다.
MS1에 대해 알아봤으니 다음 글에서는 MS2(MS/MS)에 대해 알아보도록 하겠다.
